満嶋　明

　　目次

　【１】　概論
　【２】　AODO法の準備
　【３】　AODO法の手技
　【４】　コツと理解
　【５】　その他
　      　文献


【１】概論　　　　　　　　　　　　【目次に戻る】
　

1981年に田中・名黒によって Osmium-DMSO-Osmium 法（ODO法）（文献1）が開発された。これは細胞内構造を走査電顕で観察するための試料作製法である。オスミウム固定した細胞を凍結して割断し、観察に不要な構造物を希薄なオスミウム溶液で取り除く（この過程を「浸軟処理」と呼ぶ）という特徴を持っている。 　AODO法（Aldehyde prefixed osmium-DMSO-osmium method）（文献2）は、オリジナルのODO法の変法であり、アルデヒド灌流固定を初期固定として採用し、より汎用性を高めたものである。ここでは、AODO法の解説を行う。

● AODO法は以下の手順で構成されている。 　　１）固定　　：　アルデヒド・オスミウム二重固定 　　２）凍結割断：　細胞を凍結して割断し、細胞内部を露出させる 　　３）浸軟処理：　割断した面から余分な細胞基質を希薄なオスミウム溶液で溶解・除去する　　　　　　　　　　 　　４）導電染色：　試料に導電性・強度を付加する 　　５）乾燥　　：　脱水の後、試料を変形なく乾燥させる 　　６）金属蒸着：　試料に導電性を与え、二次電子収量を増加させる このうち、固定・導電染色・乾燥・金属蒸着の４項目は走査電顕の生物試料作製で基本的で一般的な技術である。AODO法では（２）凍結割断とその直後に行う（３）浸軟処理が特徴的な技術となる。

【２】AODO法の準備　　　　　　　　　　　【目次に戻る】

AODO法に必要な物品と使用液の調整法をそれぞれ表１〜２に示した。試料作製の再現性を高めるため、使用液の濃度を常に一定にしておくことが重要である。

　　表１　準備するもの　

蒸留水・生理的食塩水・0.67Ｍ（Ｍ/15）リン酸緩衝液・パラフォルムアルデヒド・ 　25％グルタルアルデヒド溶液・2％オスミウム溶液（保存液）・タンニン酸・ 　50％Dimetylsulfoxide水溶液・液体窒素・凍結割断器・動物灌流用具一式・動物用麻酔薬

　　表２　使用液の調整法

1) アルデヒド灌流固定液：　　　　　　　　　　　 　 　 　　　25％ glutaraldehyde 8 ml 　　　 4％ formaldehyde 50 ml 　　　M/15 phosphate buffer solution 342 ml　 　 　　　（formaldehydeは、paraformaldehydeから調製） 　　　（最終濃度は、GA:0.5％、FA:0.5％ です） 　 　2) 1％オスミウム液（後固定及び導電染色用）：　　 　 　　　 2％　オスミウム保存液 2 ml 　　　M/15 phosphate buffer solution 2 ml 　 　　　（最終濃度は、1％ です） 　 　3) 0.1％オスミウム浸軟液：　　　　　　　　　　　 　 　　　 2％　オスミウム保存液 1 ml 　　　M/15 phosphate buffer solution 19 ml 　 　　　（最終濃度は、0.1％ です）

【３】AODO法の手技　　　　　　【目次に戻る】

１　固定 　　１）麻酔下で生理的食塩水（0.1％になるようにクエン酸ナトリウムを追加しておくと血液凝固を 　　　　防止できる）を灌流して脱血し、続いてアルデヒド灌流固定液（表２）を灌流する。 　　　　なお、カニュレーションは左心室や大動脈など目的に適した血管を選ぶ。 　　２）灌流後、動物から目的臓器を切り出し、1x1x3 mm 程度に細切する。これはオスミウム固定液 　　　　が1時間で組織に十分に浸透し得る大きさを意味している。 　　　　場合によっては、細切の後アルデヒド灌流固定液で10〜60分くらい浸漬固定を追加する。 　　３）M/15 phosphate buffer solution（以下、緩衝液）で十分に水洗する。 　　４）1％オスミウム液で後固定する（60〜90分）。 　　５）緩衝液または蒸留水で十分に水洗する（10分を6回以上）。　 　　２　DMSO 凍結割断 　　１）試料を50％DMSOに30分を2回以上、漬ける。 　　２）凍結割断器に液体窒素を入れて冷却しておく。 　　３）試料を凍結割断器の金属板に載せて凍結させる。 　　４）液体窒素で冷却したナイフを試料に軽く当てて試料を割断する。 　　５）割断された試料は50％DMSO溶液に戻して融解する。 　　６）緩衝液または蒸留水で十分に水洗する（10分を6回以上）。　 　　３　浸軟処理 　　１）割断後の試料を１％オスミウム液で10〜20分程度再固定する。 　　２）緩衝液または蒸留水でかるく水洗する（10分を2回程度）。 　　３）試料を20℃の浸軟溶液（0.1％オスミウム浸軟液）に入れる（72時間前後）。 　　　　時間については、次章を参考のこと。 　　　　液量は充分すぎる位に用意する（例：割断試料10ヶに対して20ml程度）。 また、濃度は低くてもオスミウムガスが出るので、パラフィルムなどで密封する。 　　　　溶液が黒く濁ってきたら（2日目、3日目）、新しい溶液（0.1％オスミウム浸軟液）に替える。 　　４）緩衝液または蒸留水で十分に水洗する（10分を6回以上）。　 　　４　導電染色 　　１）1％タンニン酸水溶液に1〜2時間漬ける。 　　２）緩衝液または蒸留水で十分に水洗する（10分を6回以上）。 　　３）1％オスミウム液（緩衝液使用）に１時間漬ける。 　　４）緩衝液または蒸留水で十分に水洗する（10分を6回以上）。 　　５　脱水と乾燥（凍結乾燥法の場合） 　　１）上昇エタノール系で脱水する（50,70,80,90,100%：15〜30分づつ）。 　　２）ｔ−ブチルアルコールに漬ける（15分を4回以上）。 　　３）試料瓶に蓋をして、冷蔵庫または冷凍庫で凍結させる。 　　４）専用凍結乾燥器に入れて乾燥させる。　 　　５’脱水と乾燥（臨界点乾燥の場合） 　　１）上昇エタノール系で脱水する（50,70,80,90,100,100,100%：15〜30分づつ）。 　　２）酢酸イソアミルに漬ける（15分を2回以上）。 　　３）乾燥用試料カゴに試料を入れて、臨界点乾燥装置に入れる。 　　　　乾燥装置に持ち込む試料の数を20ヶ以内にすると、失敗は少なくなる。 　　４）液状炭酸を注入し、何度か交換する。 　　５）温度設定を40℃にし、ガスをリークさせて乾燥させる。 　　６　金属コーティング　 　　１）試料の割断面を上に向けて、銀ペーストなどを用いて試料台に付ける。 　　２）恒温器などで十分に銀ペーストを乾燥させる（重要）。 　　３）金属コーティング装置で薄く白金などをコーティングする。 　　　　一般的には、イオンスパッタコーティングが良い。 導電染色を行っているので、数nm厚のコーティングで良い。

【４】コツと理解　　　　　　　　　　　【目次に戻る】

１.　初期固定と浸軟時間は深い関係： 　　AODO法の特徴は「一度固定しておいた細胞質の一部を、割断面から浸軟という技術で取り除く」ことにある。したがって、始めの固定 　があまりにも強固だと浸軟に時間がかかり過ぎ、しかも良い試料はできない。筆者の経験では2％GAで灌流の後、さらに12時間の浸漬固定 　を追加した試料の浸軟には１５日かかったことがある。この時の試料では細胞膜にはアーチファクトと思われる孔がたくさん出来てしまっ 　た。 　　逆に、固定が弱すぎたり、不十分だとアーチファクトを生む。試行錯誤の結果、表２に示した灌流固定液（0.5％GA + 0.5％FA ）を用い 　たのである。これは浸軟処理を行うにあたって強すぎず、弱すぎず、という前固定液である。アルデヒドによる前固定は、オスミウム固定 　（オリジナルODO法の初期固定に相当する）までの暫定的な固定であって、死後変化を最小限にくい止める程度に行うと考えると分かりや 　すいかも知れない。 　　筆者はラット（体重200ｇ程度）の場合、200mlの固定液を10〜20分かけて灌流している（固定時間の長さも固定の強さに関与するので注意 　を要する）。組織によっては、GAやFAの濃度を少し変更すると良い出来になることがある。 　　繰り返しになるが、アルデヒド初期固定と浸軟処理は表裏の関係にあり、逆に考えれば、3〜4日間で浸軟が完了するような初期固定を行う 　のが望ましい。 　 　　AODO法に最適な固定法（濃度、時間）を割り出したら、一度透過電顕用切片を作製してTEM観察して、少なくとも膜系にアーチファクトが 　無いことを確認することをお奨めする。ただし、推奨している灌流固定液は総浸透圧 400 mOsm弱と固定液としては低張ぎみであり、細胞は 　やや膨化する。AODO法のオリジナルで用いた固定液は M／15燐酸緩衝液ではなく、M／20カコジル酸緩衝液を用いたので、総浸透圧は約 300 　mOsmであった。しかし、この低張処理ともいうべき固定が浸軟効果に関与している可能性がある。いずれにせよ一度超薄切片像で固定の具合 　を観察しておくことを強くお勧めする。 　　２.　試料の大きさを考える： 　　細切するときに注意するのが大きさである。後固定のオスミウムが充分に浸透する大きさ（太さ）にする必要がある。通常、オスミウムは 　１時間に１mm 浸透すると考えられているので、せいぜい1mmφとする。細ければ長さは長くとも良いようである。割断してみたら、割断面の 　中央付近が真っ白であった場合、それはオスミウムが浸透していなかった事になる。そのような試料は捨てた方が間違いがない。また丈夫な 　被膜をもったもの、脂質に富んだ組織（脊髄や副腎など）はオスミウムの浸透が極めて遅い。被膜を取り除いたり、試料サイズを小さくする 　などの工夫を施す必要がある。なお、透過電顕試料と同様に、細切時の試料の挫滅に留意することは言うまでもない。 　　３.　凍結割断について： 　　試料を何に包埋して割断するかは重要なポイントである。エタノールや酢酸イソアミルなどの有機溶剤でも凍結割断は可能であるが、固定 　後に脱水することなくDMSOで凍結割断（文献3）すると立体的な視野の得られる出来の良い試料が得易い。 　　凍結割断は液体窒素で冷却した金属板に50％DMSOに浸漬した試料を載せて凍結固化させ、冷却したカミソリを軽く当てて行う（専用の割断 　容器がエイコーエンジニアリング(株)から販売されている）。割断が終わったら、50％DMSOの瓶に戻して融解させ、次の処理（水洗、浸軟） 　に移る。DMSO割断法のオリジナルでは40％溶液を用いているが、製品によっては40％で凍結すると氷晶が生じて真っ白くなることがある。50 　％以上の濃度を用いることをお勧めする。 　 　応用その１「双面相補観察法」（文献4）：割断した時に生じる２つの面を対応させて観察すると、より立体的な構造解明が期待できる。 　 　応用その２「凍結研磨法」（文献5）：カミソリで割ることが難しい部位の場合は、凍結研磨という手技が考案されている。50% DMSOに浸漬 　した試料を冷却した研磨用シートに何度か擦りつけると、割断と同様な美しい観察面を得ることが出来る。研磨用シートには「インペリアル 　・ラッピングシート（３Ｍ社製）」を用いる。（株）マルトー（文京区湯島1-1-10、電話 03-3251-0727）や日本電子データムが小分け包装 　したものを取り扱っている。粒度が１ミクロンのものを注文する。 　 　　４.　浸軟処理の成果： 　　割断面から観察の邪魔になる余分な細胞質を除去する浸軟処理が適切に行われると美しい立体的な観察視野が得られる。しかし、浸軟処理 　が不足すると観察目的の膜構造物と膜構造物との間に残渣が残り、立体的な像が得られない（この状態を俗に「ヌケ」が悪いという）。浸軟 　過剰になると、細胞質全部がごっそり抜けてしまって細胞膜だけになったり（逆にこの像を狙うのも面白い）、膜構造物そのものが傷んだり 　する（穴があいたり破れたりする）。 　 　　浸軟処理の程度は上述の固定強度にも関係するが、「20℃で3〜4日間」が基準となる。20℃という温度は浸軟の程度をコントロールしやす 　い温度で、もっと高いと浸軟スピードは速くなるがコントロールが難しい。低いと何日かかっても浸軟が進まない。ただ、この20℃という温 　度を実現するのは難しい場合がある。筆者らはヒーター内臓の冷蔵庫を特注して20℃の環境を得ている。寒い冬であれば専用の装置はなくて 　も恒温器や恒温水槽を20℃に設定すれば事足りる。夏はこの方法は使用できないので、工夫をしていただきたい。やや高めの温度（22〜23℃） 　でも一定であれば浸軟処理は行える。いづれにしても浸軟時間テストを十分に行ってから、試料作製を行う必要がある。　 　５.　始めての試料はテストが重要： 　　20℃で3〜4日間と上述したが、初めて浸軟を行う試料では一度「浸軟時間テスト」を行っておく。浸軟処理瓶から、２日半（６０時間）・ 　３日（７２時間）・３日半（８４時間）・４日（９６時間）というように半日づつずらして試料を取り上げ、最適な浸軟時間を割り出す。そ 　れ以上の浸軟時間が必要な時には最初の固定が強すぎたと判断する。 　６.　組織化学も併用できる： 　　0.5％ GA + 0.5％ FA の灌流固定でも失活しない酵素で、しかも重金属による検出法が存在している場合には組織化学法の併用が可能で 　ある（反射電子像観察を行う）。筆者の経験では、アルデヒド灌流固定の後、オスミウム固定を省いてDMSO割断を行い、水洗後に酸性フォ 　ァターゼ染色（Gomoriの鉛法）を施し、以下、オスミウム後固定、浸軟、導電染色、乾燥と処理をして良い結果を得ている（文献2）。 　７.　オリジナルODO法の使用： 　　どうしても灌流できない試料の時にはODO法原法を用いる。細切した未固定試料を直接1％オスミウム固定液に浸漬し（1〜2時間）、以下 　全く同じように処理する。この方法では、AODO法よりも細胞の膨化が大きく、微細な小器官が変形する場合があることに留意する。筆者の 　経験では脊髄の神経細胞に見られる細い管状の滑面小胞体（文献8）がODO法では認められなかった。堵殺から固定液が細胞に浸透するまで 　の間に生じた死後変化によるものと思われる。灌流できない試料を 0.5％ GA + 0.5％ FA に浸漬固定しても良い。この場合も死後変化の可 　能性が大きいので注意する。特にGAはオスミウムと同じくらいに浸透速度が低い。浸透の早いFAの濃度を少しあげて（1％位に）試してみる 　と良いと思われる。

【５】その他　　　　　　　　　　　　　【目次に戻る】

１.　水洗について： 　　オスミウム後固定までは必ず緩衝液を用いる。弱い固定液で短時間の固定操作であるので、膜の半透性や酵素活性などは損なわれていな 　い。緩衝液を用いるだけでなく、場合によってはショ糖等を加えて浸透圧を調整する必要である。通常、筆者は低張のM/15燐酸緩衝液（約 　150 mOsm）を用いて水洗している。これは後に行う浸軟処理に影響があるようで、細胞の多少の膨化は避けられないものの「ヌケ」の良い 　立体的な観察視野を与えてくれる。オスミウム固定の後は膜の活性は完全に失われてしまうので蒸留水で洗っても問題は全くない。（ただ 　し、オスミウム溶液そのものは必ず緩衝液を用いて調製する。） 　　なお、上述した処理時間は、1x1x3 mmの試料を２つに割断した試料、つまり1x1x0.5 mmのサイズの処理時間である。試料の大小に併せて、 　処理時間を増減すると良い。　 　２.　導電染色は必ず行う： 　　試料に オスミウムを大量に付着させることによって導電性を与え、観察中に試料におこるチャージアップを防止するのが第一目的である 　が、他にも捨てがたい効用がある。まず試料を固くするので、1）脱水や乾燥時の試料の収縮の軽減、2）金属コーティング時のダメージ軽 　減、3）観察中の電子ビームによるダメージ軽減、などの大きな効果が得られる。また導電性が与えられるので、4）金属コーティングを薄 　くすることが出来る。用いている方法は、村上のタンニン・オスミウム法（文献6）の変法で、使用濃度を落としている。 　3.　良い乾燥法でも失敗する： 　　試料に変形を与えずに乾燥する方法は「臨界点乾燥法」と「t-ブチルアルコール凍結乾燥法（文献7）」の２法が知られている。他にも方法 　はあるがこの２法が簡便で失敗が少ない。筆者は、高圧を発生させず（より安全で）、しかも失敗のより少ない（乾燥用の溶媒交換をチャン 　バー内ではなく、目の前の試料瓶で行うことが出来る）ことから後者を専ら愛用している。しかし、どちらの方法も良い方法であるが、操作 　が悪いと必ず「失敗」する（乾燥の失敗像をよく見かける）。 　 　　失敗の原因は、乾燥前の最終使用液への不充分な置換である。臨界点乾燥の場合は、酢酸イソアミルから「液状炭酸」への置換、t-ブチル 　アルコール凍結乾燥の場合は脱水用のエタノールから「t-ブチルアルコール」への置換が重要である。 　　超高分解能SEMでの観察の場合には、コンタミ防止のために臨界点乾燥を奨める（凍結乾燥では真空装置のオイルミストで試料が確実に汚染 　される）。特に３０万倍以上で観察する場合に問題になってくるもので、一般的な観察の場合はt-ブチルアルコール凍結乾燥法でも全く問題 　ない。 　4.　金属コーティングについて： 　　金属コーティングには「蒸着」と「スパッタリング」という２法が知られている。AODO法で作製した試料には、粒状性の良いこと、コー 　ティング膜の均一性などから、イオン・スパッタリング装置でスパッタ・コーティングするのが望ましい。使用金属は白金や金（それらとパ 　ラジウムとの合金）などが良い。2〜3nm厚のコーティングで、チャージアップを防止し、明るい像を得ることが出来る。30万倍位までは簡単 　に撮影が可能となる。 　　最近「マグネトロン型」のイオンスパッタ装置が販売されている。金属ターゲットに磁石を用いて、コーティング中に電子線が試料を叩く 　のを防いでいるので、脆弱な試料には適している。また、飛びにくい金属（クロムなど）でも比較的低い電圧でスパッタリングが行えると 　いった利点がある。 　5.　高倍率観察ではデコレーションに注意： 　　高倍率（10万倍以上）で観察する場合には、試料へのデコレーションというアーチファクトを考慮に入れる。最大のデコレーションは、導 　電染色中の「タンニン酸処理」と「金属コーティング」で生じる。タンニン酸は高濃度・高温度・長時間で溶液中でたやすく重合して大きな 　分子になる。溶液を調製する時に加温するのは避ける（超音波洗浄器を利用する方が良い）。高倍率観察が目的の場合には、タンニン酸溶液 　を、1)使用直前調製、2)1％以下、3)室温以下（出来れば10℃以下）、4)1時間以内、という条件で使用すると良い（そのためには、試料その 　ものを小さい方がよい）。金属コーティングもデコレーションそのものである。なるべく薄くコーティングする。高倍率の時は1nm厚程度に 　する（細胞膜の厚さは約7.5nm）。　 　６.　観察できるもの： 　　ほとんどの細胞内の膜系構造物は観察可能である。細胞膜、核膜、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリアの膜部分、ライソゾームなど、は 　立体的に観察される。リボゾーム、脂肪滴、ミトコンドリアのＦ0Ｆ1 粒子も観察できる。ただし、細胞質中に浮かんでいる小型の膜系構造 　物（ゴルジ小胞や時にはミトコンドリアも）は除去されてしまう。核質は残るが何がどの程度残っているかが分かっていないので、所見を取 　るには注意が必要である。アクチンと微細管は完全に溶ける。中間径フィラメントは場合により多少残っている時があるが、すべてが完全に 　残っているとは考えにくいので所見は取りにくい。

文献　　　　　　　　　　　　【目次に戻る】

1) TANAKA, K. & NAGURO, T.: High resolution scanning electron microscopyof cell organelles by a new specimen preparation method. 　　Biomed. Res., 2 (Suppl.), 63-70, 1981. 2) TANAKA, K. & MITSUSHIMA, A.: A preparation method for observing intracellular structures by scanning electron microscopy. 　　J. Microsc.,133, 213-222, 1984. 3) TOKUNAGA, J., EDANAGA, M., FUJITA, T. & ADACHI, K.: Freeze cracking of scanning electron microscope specimens. A study of the 　　kidney and spleen. Arch. Histol. Jpn., 37, 265-182, 1974. 4) INOU T. & OSATAKE, H.: Complementary observation on fractured intracellular structures, especially the Golgi apparatus, by 　　scanning electron microscopy. J. Electron Microsc., 21, 806-807, 1988 5) INOU T. & OSATAKE, H.: Three-dimensional demonstration of the intracellular structures of mouse mesothelial cells by 　　scanning electron microscopy. J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 21, 215-227, 1989 6) MURAKAMI, T.: A revised tannin-osmium method for non-coated scanning electron microscope specimens. 　　Arch. Hist. Jpn., 36, 189-193, 1976. 7) INOU T. & OSATAKE, H.: A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: The t-butyl alcohol 　　freeze-drying method. Arch. Histol. Cytol., 51, 53-59, 1988. 8) TANAKA, K., MITSUSHIMA, A., FUKUDOME, H. et al.: Three-dimensional architecture of the Golgi complex observed by high 　　resolution scanning electron microscopy. J. Submicrosc. Cytol., 18, 1-9, 1986

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